本文由華中科技大學(xué)馬聰課題組與中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院何俊團(tuán)隊(duì)合作完成，揭示膜融合調(diào)控因子 Munc13-4 在腫瘤外泌體 PD-L1 分選與分泌中的關(guān)鍵作用。該研究不僅解析了免疫逃逸的新機(jī)制，也提出了靶向 Munc13-4–PD-L1 相互作用以提升免疫治療響應(yīng)的新策略。

背景

PD-L1–PD-1 軸是腫瘤免疫逃逸的經(jīng)典途徑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞不僅通過膜表 PD-L1 抑制 T 細(xì)胞，還能將 PD-L1 裝載入外泌體，經(jīng)血液循環(huán)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程免疫抑制。然而，PD-L1 如何被選擇性分選并經(jīng)外泌體分泌仍不清楚。本研究揭示，膜融合調(diào)控因子 Munc13-4 是腫瘤細(xì)胞外泌體 PD-L1 分選與分泌的關(guān)鍵分子，闡明其與 HRS–Rab27–SNARE 協(xié)同完成外泌體釋放的機(jī)制，并證明干預(yù) Munc13-4 能增強(qiáng)免疫治療響應(yīng)。

結(jié)論1 Munc13-4 在多種腫瘤中高表達(dá)，敲除后顯著抑制腫瘤生長

多癌種組織芯片及 TCGA 數(shù)據(jù)分析顯示，Munc13-4 在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤中普遍高表達(dá)。研究者利用 CRISPR-Cas9 敲除 4T1 乳腺癌細(xì)胞中的 Munc13-4，結(jié)果在小鼠原位模型中顯著抑制腫瘤生長，腫瘤體積僅為對照的約17%。進(jìn)一步在免疫缺陷小鼠（Nude、NOD/SCID）中對比發(fā)現(xiàn)，缺乏 T 細(xì)胞或wan全免疫缺陷后，這種生長抑制效應(yīng)基本消失，提示 Munc13-4 促進(jìn)腫瘤進(jìn)展依賴完整免疫系統(tǒng)。該結(jié)果確立了 Munc13-4 在腫瘤免疫逃逸中的關(guān)鍵地位。

Fig1. Munc13-4 缺失通過免疫依賴性機(jī)制抑制乳腺癌生長

結(jié)論2 Munc13-4 缺失增強(qiáng)腫瘤特異性 T 細(xì)胞浸潤與活化

為探究 Munc13-4 缺失如何影響免疫反應(yīng)，研究者分析了腫瘤、脾臟及淋巴結(jié)中的免疫細(xì)胞組成。流式及免疫熒光結(jié)果顯示，Munc13-4 敲除顯著增加腫瘤內(nèi) CD4? 與 CD8? T 細(xì)胞浸潤，并提升其活化水平；T 細(xì)胞表達(dá)的 Granzyme B、Ki67 與 IFNγ 均顯著上升。脾臟和引流淋巴結(jié)中亦觀察到相似趨勢，表明系統(tǒng)性 T 細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)。結(jié)果說明，Munc13-4 的缺失能解除腫瘤對 T 細(xì)胞的抑制，強(qiáng)化免疫監(jiān)視和殺傷效應(yīng)，從而抑制腫瘤生長。

Fig2. Munc13-4 缺失增強(qiáng) T 細(xì)胞浸潤與細(xì)胞毒活性

結(jié)論3 Munc13-4 促進(jìn)外泌體分泌與其中 PD-L1 的富集

研究進(jìn)一步探討 Munc13-4 介導(dǎo)免疫抑制的分子基礎(chǔ)。雖然敲除 Munc13-4 不影響細(xì)胞總 PD-L1 含量及膜表水平，但外泌體分泌顯著減少，且外泌體中 PD-L1 含量下降約70%。來自 Munc13-4 缺失細(xì)胞的外泌體對活化 CD8? T 細(xì)胞的殺傷抑制作用明顯減弱，而向小鼠注入對照細(xì)胞來源外泌體則可恢復(fù) Munc13-4 缺失腫瘤的免疫逃逸和生長。該結(jié)果表明，Munc13-4 通過促進(jìn) PD-L1 隨外泌體分泌至細(xì)胞外，削弱 T 細(xì)胞殺瘤能力，是腫瘤免疫抑制的核心調(diào)控節(jié)點(diǎn)。

Fig3. Munc13-4 促進(jìn) PD-L1 外泌體分泌，削弱 T 細(xì)胞殺傷能力

結(jié)論4 Munc13-4 缺失提升免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效

鑒于 Munc13-4 缺失可減弱免疫抑制，作者評估其對免疫檢查點(diǎn)抑制療法的影響。在原位乳腺癌模型中，野生型腫瘤對抗 PD-1 或抗 PD-L1 單抗治療反應(yīng)不明顯，而 Munc13-4 缺失腫瘤對兩種治療均顯著敏感，腫瘤體積下降、延緩進(jìn)展。結(jié)果提示，阻斷 Munc13-4 可顯著增強(qiáng) ICB 療效，為聯(lián)合免疫治療提供新的分子靶點(diǎn)。

Fig4. Munc13-4 缺失顯著提高抗PD-1/PD-L1療效

結(jié)論5 Munc13-4 與 Rab27a、SNARE 協(xié)同促進(jìn) MVB 融合

為闡明 Munc13-4 調(diào)控外泌體釋放的結(jié)構(gòu)機(jī)制，作者解析了 Munc13-4–Rab27a 復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（3.4 ?），揭示關(guān)鍵界面殘基 F46、W73、F88（Rab27a）與 N739、T740、V660、K661（Munc13-4）的相互作用。突變這些殘基顯著削弱結(jié)合，導(dǎo)致多泡體（MVB）靠膜對接受阻、外泌體釋放量下降。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，Munc13-4 可促進(jìn) SNARE 復(fù)合物（Syntaxin-4/SNAP-23/VAMP7）組裝并增強(qiáng)膜融合。該部分確立了 Munc13-4 在 MVB 融合與外泌體分泌中的分子作用機(jī)制。

Fig5. Munc13-4–Rab27a–SNARE 復(fù)合體促進(jìn) MVB 融合與外泌體分泌

結(jié)論6 Munc13-4 與 HRS 共同介導(dǎo) PD-L1 外泌體分選

Munc13-4 不僅調(diào)控外泌體釋放，還決定 PD-L1 的裝載。共聚焦顯示，Munc13-4 缺失導(dǎo)致 PD-L1 由與 CD63 共定位轉(zhuǎn)為與溶酶體標(biāo)志 LAMP1 共定位，提示其被錯(cuò)誤降解。HRS（ESCRT-0組分）敲除同樣減少外泌體 PD-L1。免疫共沉淀及 PLA 分析發(fā)現(xiàn) Munc13-4 同時(shí)與 HRS 和 PD-L1 結(jié)合，三者形成穩(wěn)定復(fù)合體；HRS 缺失不影響 Munc13-4–PD-L1 結(jié)合，說明 Munc13-4 與 HRS 協(xié)同而非依賴關(guān)系。結(jié)果揭示 Munc13-4–HRS–PD-L1 三元復(fù)合體是 PD-L1 被準(zhǔn)確分選入外泌體的關(guān)鍵機(jī)制。

Fig6. HRS–Munc13-4–PD-L1 復(fù)合體決定 PD-L1 外泌體分選

結(jié)論7 IFNγ 信號通過修飾 Munc13-4 與 HRS 動態(tài)調(diào)節(jié) PD-L1 分選

最后，作者發(fā)現(xiàn) IFNγ 信號可通過翻譯后修飾動態(tài)調(diào)節(jié) Munc13-4–HRS 復(fù)合體功能。IFNγ 顯著上調(diào) PD-L1 蛋白并增加外泌體 PD-L1 載量，卻不改變外泌體總數(shù)。機(jī)制上，IFNγ 促進(jìn) CBP 介導(dǎo)的 Munc13-4 乙酰化，抑制其促進(jìn)分選的功能；同時(shí)觸發(fā) HRS 去泛素化（由 NEDD4L/USP8 調(diào)控），增強(qiáng)其裝載能力。兩種修飾方向相反，gong同平衡 PD-L1 外泌體輸出。該結(jié)果揭示 IFNγ 信號通過精細(xì)調(diào)控 Munc13-4 與 HRS 的修飾狀態(tài)，動態(tài)塑造腫瘤免疫逃逸能力。

Fig7. IFNγ 通過乙酰化/去泛素化精細(xì)調(diào)控外泌體 PD-L1 裝載

總結(jié)與展望

本研究系統(tǒng)揭示了 Munc13-4–HRS–Rab27–SNARE 信號軸在外泌體 PD-L1 分選與分泌中的全程作用機(jī)制：Munc13-4 與 Rab27a、SNARE 復(fù)合體協(xié)同驅(qū)動 MVB 融合釋放，同時(shí)通過與 HRS、PD-L1 形成復(fù)合體完成 PD-L1 裝載；IFNγ 通過乙酰化與去泛素化修飾進(jìn)一步調(diào)節(jié)此過程。研究還設(shè)計(jì)了能阻斷 Munc13-4–PD-L1 結(jié)合的肽段，顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫與檢查點(diǎn)療法療效。該成果定義了外泌體免疫逃逸的新機(jī)制，并提出“靶向 Munc13-4 介導(dǎo)的外泌體通路"作為提升免疫治療反應(yīng)的新方向。