KO小鼠模型構建方法及應用

1. 構建方法

傳統同源重組技術：通過在胚胎干細胞（ES細胞）中引入目標基因的突變，并插入選擇性標記基因（如抗性基因）來失活目標基因。這種方法的優點是精確度高，但構建過程較為復雜，周期較長。

基因編輯技術（如CRISPR/Cas9）：利用CRISPR/Cas9系統，研究人員可以在受精卵或胚胎階段快速實現單個或多個基因的敲除。CRISPR/Cas9技術具有操作簡單、效率高、成本低等優點，已成為構建KO小鼠模型的主流方法。

顯微注射法：將CRISPR/Cas9系統組分（如Cas9蛋白、gRNA）通過顯微注射的方式注入小鼠受精卵的原核或細胞質中，然后將編輯后的受精卵移植到代孕母鼠體內。

電穿孔法：通過電脈沖將CRISPR/Cas9系統組分導入受精卵或胚胎細胞中，提高基因編輯的效率。

2. 基因型鑒定

PCR鑒定：利用特異性引物進行PCR擴增，可以快速鑒定KO小鼠。這種方法適用于初步篩選轉基因陽性小鼠。

Southern blotting：通過限制性酶切和探針雜交來檢測KO小鼠的基因整合情況和拷貝數。這種方法可以提供關于基因整合位點和拷貝數的詳細信息。

3. 應用

疾病模型構建：KO小鼠模型被廣泛用于模擬人類疾病的發生發展，研究基因在疾病中的生物學功能。例如，通過敲除腫瘤抑制基因Tp53，能夠構建小鼠腫瘤模型，幫助研究腫瘤的發生和發展機制。

基因功能研究：通過敲除特定基因，可以研究其在細胞發育、免疫反應、代謝等方面的作用，在基因功能解析和疾病機制研究中占據重要地位。

藥物篩選和驗證：KO小鼠模型可用于藥物篩選和驗證，評估藥物的療效和安全性，幫助驗證治療靶點的有效性，促進新藥的研發。

實例

Pcoke2-null小鼠模型：通過將Pcoke2基因的大部分外顯子3替換為IREs-laz/新mei素抗性盒來生成Pcoke2-null胚胎。將胚胎注入C57BL/6雌性小鼠體內，后代與C57BL/6小鼠交配，產生野生型（WT）和Pcoke2-null（KO）小鼠。

ACE2基因敲除小鼠模型：多個研究團隊利用傳統同源重組、TALEN技術和CRISPR/Cas9技術構建了ACE2基因敲除（KO）小鼠模型。這些模型在研究ACE2的生物學功能病理機制中具有重要價值。