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同源重組實驗

簡要描述:同源重組實驗是一種依賴DNA序列相似性(同源臂)的精準基因編輯技術,通過外源載體與宿主基因組間的序列交換實現靶向修飾。

  • 更新時間:2025-07-17
  • 瀏覽次數:296

詳細介紹

一、定義與分子機制

同源重組是一種依賴DNA序列相似性(同源臂)的精準基因編輯技術,通過外源載體與宿主基因組間的序列交換實現靶向修飾。其核心機制包括:

  1. 同源臂介導的精準定位

    • 外源載體兩端設計≥1 kb的同源臂(與靶基因側翼序列一致),引導載體與基因組特異性結合(避免隨機插入)。

  2. DNA斷裂修復與交換

    • 內源核酸酶(如Cas9)或自發損傷誘導 雙鏈斷裂(DSB) → 細胞啟動同源定向修復(HDR) → 以載體為模板合成新鏈,實現基因替換/插入。

  3. 關鍵分子參與者

    • RecA/Rad51:介導DNA鏈配對與交換

    • BRCA1/2:調控修復路徑選擇(HR vs. NHEJ)

生物學意義:HR是wei一能實現單堿基至大片段精準替換的自然修復機制,區別于易出錯的非同源末端連接(NHEJ)。


二、技術流程與關鍵步驟

1. 載體設計策略

元件功能案例
長同源臂提升重組效率(1-10 kb)小鼠基因敲除常用3 kb臂
正篩選標記新霉su抗性(Neo^R)等,篩選重組細胞中的"Selection"標記
負篩選標記HSV-TK(更昔luo韋敏感),淘汰隨機插入細胞中的Gancyclovir反選
條件性刪除系統Cre/loxP或FLP/FRT,移除篩選標記的LOXP重組

2. 細胞工程化改造

  • 胚胎干細胞(ESC)打靶

    1. 電穿孔導入線性化載體 → G418篩選陽性克隆

    2. PCR/Southern驗證重組位點(避免隨機整合)

       
  • CRISPR-HR聯用

    • Cas9切割靶位點 → 同步提供HR模板(效率提升50倍)

3. 動物模型構建流程

注:傳統ESC/HR流程需6-12個月,CRISPR-HR可縮短至3個月。


三、應用場景與突破案例

1. 疾病模型構建

模型類型技術方案疾病研究價值
基因敲除小鼠HR替換致病基因為終止子囊性纖維化、癌癥機制研究
點突變模型HR引入特定SNP(如APOE4)阿爾茨海默癥藥物篩選
人源化模型HR插入人類基因片段(如IL-2)免yi治療評估

2. 生物醫藥生產

  • 治療性蛋白載體

    • HR將人抗凝xue酶III基因插入山羊β-酪蛋白位點 → 乳汁中表達藥用蛋白(產量>1g/L)

  • 基因治療修復

    • HR修正β-珠蛋白突變 → 治療β-地中海貧血(臨床前階段)

3. 合成生物學

  • 染色體工程

    • Cre/loxP介導大片段重組 → 構建環形人工染色體(中的MI系統)


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